Анализ на менингококковую инфекцию

. Спинно-мозговаяжидкость

,0 мл направляют в клиническую лабораторию для проведения
общего ликворологического
и цитологического исследования;

,2 мл направляют для постановки полимеразной цепной
реакции, которую выполняют в лабораториях, специально оснащенных всем
необходимым для проведения такого рода исследований и имеющих разрешение на
данный вид деятельности в установленном порядке;

https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertiseru

,0 мл направляют для первичного бактериологического посева
(если не сделан в отделении при пункции), бактериоскопии и серологических
исследований;

,5 мл засевают в чашку с «шоколадным» агаром
непосредственно у постели больного. Далее чашку хранят в условиях термостата
при 37 °С до доставки в лабораторию. Применение данной методики позволяет
получить культуру возбудителя бактериального менингита на 18 – 24 часа раньше, чем по стандартной схеме
посева материала в лаборатории и тем самым ускорить проведение исследования и
выдачу ответа;

Анализ на менингококковую инфекцию

,5 мл ликвора засевают в среду обогащения (в 5,0 мл 0,1
%-го полужидкого питательного агара) непосредственно у постели больного и далее
хранят при 37 °С в условиях термостата до доставки в лабораторию.

.
Бактериоскопия

На предметное
стекло наносят каплю ликвора из осажденного после центрифугирования слоя и
высушивают при комнатной температуре или в условиях термостата при 37 °С.
Далее на препарат наносят краситель (водно-спиртовой раствор метиленовой сини)
и после 2-минутной экспозиции проводят тщательное, но осторожное промывание
водопроводной водой.

На обезжиренное
стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора. В нем суспензируют
культуру и туда же петлей вносят каплю спиртового раствора бриллиантовой
зелени. После подсыхания препарат фиксируют над пламенем. Затем на препарат
наливают основной краситель. Время экспозиции 1,5 – 2,0 мин.

После этого краску сливают и стекло в наклонном
положении промывают водой. Далее препарат в наклонном положении отмывают
спиртом до отхождения облачков краски и немедленно промывают водой. Затем
производят докрашивание препарата водным раствором фуксина в течение 2 мин,
после этого окончательно промывают водой и просушивают.

На середину предметного
стекла наносят каплю крови и распределяют с помощью чистого стерильного
апликатора так, чтобы диаметр мазка соответствовал величине пятикопеечной
монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Данный
фрагмент исследования выполняют непосредственно у постели больного при его
поступлении в стационар.

Далее препарат доставляют в бактериологическую
лабораторию. Окраску мазка производят водно-спиртовым раствором метиленовой
сини в течение 2
– 3 мин, без
предварительной фиксации. После окрашивания препарат осторожно промывают водой
и подсушивают на воздухе. Препарат смотрят под иммерсией при большом
увеличении, просматривая не менее 20 полей зрения или до обнаружения
морфологически четких микробных клеток.

. Кровь

·    для
бактериологического посева на гемокультуру отбирают – 5,0 –
10,0 мл крови у взрослых; 2,0 – 5,0 мл – у детей и 1,0
– 2,0 мл – у
новорожденных и детей неонатального периода;

,0 –
5,0 мл крови используют для серологических
исследований с целью выявления специфических антигенов (встречный
иммуноэлектрофорез – ВИЭФ) и специфических антител (реакция непрямой
гемагглютинации – РНГА). Для получения
достоверных результатов о нарастании титров антител в реакции РНГА важно
исследовать парные сыворотки, т.е. сыворотки крови, взятые в первые дни болезни
при поступлении больного в стационар и затем на 10 – 12-й день заболевания;

·    несколько капель
крови наносят на предметное стекло для приготовления препарата «толстой капли»
крови.

. Бактериологическийпосев

При отборе и
посеве исследуемого материала следует соблюдать следующие требования: исключить
случайную контаминацию материала посторонней микрофлорой и не допустить гибели
возбудителя с момента взятия материала для анализа и до начала работы с ним в
лаборатории. Первое условие обеспечивают правильным забором материала, точным
доступом к очагу инфекции, соблюдением асептики;

https://www.youtube.com/watch?v=upload

Первичный
бактериологический посев СМЖ на чашку с «шоколадным» агаром выполняют
непосредственно «у постели больного» в стационаре после проведения пункции.
Чашки с питательной средой, так же как и все необходимые для забора
патологического материала принадлежности (пустые стерильные пробирки, пробирки
с 0,1 %-м полужидким сывороточным агаром, стерильные предметные
стекла для приготовления препарата «толстая капля» крови, флаконы с
питательными средами для посева крови) в достаточном количестве хранят в
профильном отделении стационара или их немедленно (при необходимости)
доставляют из бактериологической лаборатории.

Допустимым условием хранения емкостей
с питательными средами является температура бытового холодильника (4 °С). Срок
хранения – не более 7 дней. Перед пункцией емкости с питательными средами
достают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее
10 мин. После проведения пункции непосредственно из пункционной иглы выполняют
посев СМЖ на чашку с «шоколадным» агаром.

Чашку осторожно открывают и на
поверхность среды закапывают несколько капель ликвора (3 –
4 капли). Далее чашку закрывают, ставят на
ровную поверхность и с помощью нескольких круговых движений чашки по
поверхности стола капли ликвора распределяют по поверхности агара. После того
как СМЖ впитается (обычно 2 – 3 мин), необходимо зафиксировать дно и крышку чашки
(например пластырем) для того, чтобы не возникло ее случайного открытия.

Посев
СМЖ в пробирку с 0,1 %-м полужидким
сывороточным агаром проводят сразу после пункции. Для этого непосредственно из
пункционной иглы 5 – 6 капель СМЖ вносят в пробирку с 0,1 %-м полужидким сывороточным агаром. Следует указать на то,
что если непосредственно у постели больного сделан посев СМЖ по вышеизложенному
способу, то этап посева нативной СМЖ в лаборатории следует исключить, при этом
доставленную в лабораторию стерильную СМЖ исследуют только бактериоскопическими
и серологическими методами.

Емкости с посевами до доставки в лабораторию хранят
в условиях термостата при 37 °С или немедленно доставляют в бактериологическую
лабораторию. В бактериологической лаборатории посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 – 48 ч в атмосфере, содержащей 5 – 10 % СО2 (эксикатор со свечой, СО2-инкубатор).

При наличии роста на плотных питательных
средах проводят визуальную оценку выросших колоний, готовят мазок по Граму,
определяют оксидазу, каталазу и в зависимости от полученного результата проводят
дальнейшую идентификацию возбудителя и определение чувствительности к
антибиотикам. При наличии признаков роста в 0,1 %-м полужидком сывороточном агаре проводят высев на чашки с
«шоколадным» агаром. Культивацию посевов и дальнейший ход исследований проводят
так же, как описано выше.

Посев крови
выполняют во флаконы с «двухфазной» питательной средой в соотношении крови к
жидкой фазе 1:10 для уменьшения бактерицидного эффекта человеческой сыворотки.
«Двухфазная» питательная среда содержит X, V факторы роста и витамины. На ней
хорошо растут менингококки, пневмококки, гемофильные палочки и другие менее
требовательные к составу питательной среды микроорганизмы.

Представляется
перспективным использование готовых «двухфазных» сред для посева крови,
разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке. Эти
среды сбалансированы по питательным свойствам, обогащены различными ростовыми
добавками, содержат вещества, инактивирующие действие сыворотки крови и
антибиотиков, имеют оптимальный газовый состав.

Засеянную в
отделении кровь доставляют в лабораторию и инкубируют в течение 5 суток при
температуре 37 °С. Посевы ежедневно просматривают на наличие микробного роста.
Признаками микробного роста на «двухфазной» среде служат помутнение жидкой
среды, наличие хлопьевидного осадка, газообразование,
образование пленки. Часто изменения «жидкой» фазы среды сопровождаются ростом
колоний на «плотной» фазе среды.

В связи с тем,
что рост некоторых микробов не приводит к визуально заметным изменениям
прозрачности и цвета жидкой фазы питательной среды рекомендуется выполнить
посев на «шоколадный» агар через 48 ч инкубации, даже несмотря на отсутствие
признаков микробного роста во флаконе. При отрицательном результате посева
следует продолжить инкубирование флакона.

В случае
обнаружения роста микроорганизмов в «двухфазной» питательной среде, флакон
вскрывают и из бульона или выросших на твердой фазе колоний готовят мазок,
окрашенный по Граму. По результатам микроскопии выполняют высев на чашки с
«шоколадным» агаром для выделения менингококков, пневмококков и гемофильных
палочек типа «b».

После получения
роста микроорганизмов на плотных средах из выросших колоний готовят мазок по Граму,
определяют оксидазу, каталазу и проводят дальнейшую биохимическую,
серологическую идентификацию, определяют чувствительность к антибиотикам.

https://www.youtube.com/watch?v=ytdevru

Посев выполняют
немедленно после забора материала или после доставки материала в лабораторию на
чашки с сывороточным агаром и на чашки с селективным сывороточным агаром (в
качестве селективной добавки используют линкомицин). Материал засевают путем
втирания тампона на четверть чашки. Оставшуюся часть агара на чашке засевают
штриховым методом с помощью стерильной бактериологической петли.

Засеянные
чашки инкубируют в условиях термостата при 37 °С течение 24 ч. При обнаружении
колоний, визуально сходных с ростом менингококков, выполняют отсев на чашки с
сывороточным агаром. После культивирования посевов в условиях термостата при 37
°С из выросших колоний готовят мазок по Граму в модификации Калины, определяют
оксидазу, каталазу и проводят дальнейшую идентификацию.

. Назофарингеальнаяслизь

Назофарингеальную
слизь с задней стенки глотки берут натощак или через 3 – 4 часа после еды
стерильным ватным тампоном. Материал берут с обязательным надавливанием шпателем
на корень языка для наиболее полного открытия глоточного отверстия. Тампон
вводят ватным концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2 – 3 раза по задней стенке.

При извлечении из носоглотки тампон не должен касаться окружающих тканей (зубы,
слизистая щек, язык, небный язычок). После извлечения из носоглотки
содержащуюся на тампоне слизь засевают на чашки (сывороточный агар и
сывороточный агар с линкомицином) или помещают в транспортную среду для
немедленной доставки в лабораторию. Допускается применение готовых питательных
транспортных сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в
установленном порядке.

. Встречныйиммуноэлектрофорез (ВИЭФ
– экспресс-метод)

Наиболее простым
методом, не требующим сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, является
метод латекс-агглютинации, позволяющий в течение 15 мин дать
заключение об отсутствии или наличии в СМЖ больного специфических антигенов.
Реакцию проводят при наличии признаков гнойного воспаления в ликворе и/или при бактериоскопическом обнаружении в нем возбудителей.

Предварительно СМЖ необходимо прогреть в течение 5 мин при 100 °С и отцентрифугировать при 1500 – 2000 об./мин. Для проведения
реакции используют прозрачную надосадочную жидкость. Одну каплю каждого
латексного реактива (предварительно реактивы рекомендуется тщательно
встряхнуть) наносят на специальные бумажные карты, приложенные к набору.

Затем
добавляют 30 мкл СМЖ (надосадочная фракция) к каждой капле латексного реактива.
Перемешивают чистым аппликатором. Осторожно покачивают бумажную карту.
Агглютинация в течение 2 мин с одним из латекс-диагностических препаратов
свидетельствует о присутствии в испытуемом образце специфического антигена.

Реакция
позволяет с помощью специфических антисывороток выявлять полисахаридный антиген
возбудителя в СМЖ и сыворотке крови больного уже в первый день исследования
материала. Для проведения реакции необходимы: проба СМЖ (осадок, если ликвор
мутный) и/или сыворотка крови, преципитирующие антисыворотки,
веронал-мединаловый буфер, 1 %-й агар на веронал-мединаловом буфере, любой
аппарат для иммуноэлектрофореза, стеклянные пластины размером 9´12 см,
трафареты, пробойники для агара, отсасывающие агар устройства, пастеровские
пипетки или дозаторы с наконечниками, фильтровальная бумага,
предметный столик или другой объект с идеально ровной поверхностью.

В аппарат для
иммуноэлектрофореза заливают веронал-мединаловый буфер, содержащий в 1 л
дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,35 г веронала (веронал предварительно
нагревают на водяной бане в небольшом количестве дистиллированной воды до
полного растворения). Измеряют рН и доводят его до уровня 8,6.

Далее на
веронал-мединаловом буфере (предварительно развести дистиллированной водой в 4
раза) готовят 1 %-й агар. На 100 мл буфера добавляют 1 г агара, нагревают на
водяной бане до полного растворения и в горячем, но несколько охлажденном виде
(60 – 70 °С) в количестве 20 мл наносят на стеклянные пластины
размером 9×12 см.

Специфические
антисыворотки вносят в лунки агара со стороны анода ( ), а испытуемую пробу СМЖ
и/или сыворотку крови – со стороны катода (-). В отдельные
лунки помещают положительный контроль. В качестве положительного контроля
используют антигенный препарат (полисахарид) и гомологичную антисыворотку.

https://www.youtube.com/watch?v=ytcreatorsru

Подготовленную пластину помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза, соединяют
стекло и буфер с помощью фильтровальной бумаги и включают аппарат в сеть. Время
экспозиции 20 – 30 мин при силе тока 12 ма. Результат учитывают через 10 мин
после выключения аппарата. Реакцию считают положительной, если между лунками
проявляются четкие линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Все о головных болях
Adblock detector